Differenza chiave - NGS vs Sanger Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) e Sanger Sequencing sono due tipi di tecniche di sequenziamento nucleotidico sviluppate nel tempo. Il metodo Sanger Sequencing è stato ampiamente utilizzato per molti anni e NGS lo ha sostituito di recente per i suoi vantaggi. La differenza fondamentale tra NGS e Sanger Sequencing è che NGS funziona secondo il principio di sequenziare milioni di sequenze simultaneamente in modo rapido attraverso un sistema di sequenziamento mentre Sanger Sequencing lavora sul principio della terminazione della catena a causa dell'incorporazione selettiva di dideoxynucleotides da parte dell'enzima DNA polimerasi durante la replicazione del DNA e la conseguente separazione dei frammenti mediante elettroforesi capillare.
INDICE
1. Panoramica e differenza chiave
2. Che cos'è il sequenziamento dei nucleotidi
3. Che cos'è l'NGS
4. Che cos'è il sequenziamento di Sanger
5. Confronto affiancato - NGS vs sequenziamento di Sanger
6. Riepilogo
Cos'è il sequenziamento dei nucleotidi?
Le informazioni genetiche sono immagazzinate nelle sequenze nucleotidiche del DNA o dell'RNA di un organismo. Il processo di determinazione dell'ordine corretto dei nucleotidi (utilizzando quattro basi) in un dato frammento (in un gene, cluster di geni, cromosoma e genoma completo) è noto come sequenziamento dei nucleotidi. È molto importante negli studi genomici, studi forensi, virologia, sistematica biologica, diagnosi medica, biotecnologia e in molti altri campi per analizzare la struttura e la funzione dei geni. Esistono diversi tipi di metodi di sequenziamento sviluppati dagli scienziati. Tra questi, il sequenziamento Sanger sviluppato da Frederick Sanger nel 1977 è stato ampiamente utilizzato e reso popolare per un lungo periodo di tempo fino a quando Next Generation Sequencing lo ha sostituito.
Cos'è NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) è un termine usato per riferirsi ai moderni processi di sequenziamento ad alto rendimento. Descrive una serie di diverse moderne tecnologie di sequenziamento che hanno rivoluzionato gli studi genomici e la biologia molecolare. Queste tecniche sono il sequenziamento Illumina, il sequenziamento Roche 454, il sequenziamento Ion Proton e il sequenziamento SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection). I sistemi NGS sono più veloci ed economici. Quattro principali metodi di sequenziamento del DNA sono utilizzati nei sistemi NGS e precisamente; pirosequenziamento, sequenziamento per sintesi, sequenziamento per legatura e sequenziamento di semiconduttori ionici. Un gran numero di filamenti di DNA o RNA (milioni di) può essere sequenziato parallelamente. Consente il sequenziamento dell'intero genoma degli organismi in un breve periodo di tempo, a differenza del sequenziamento di Sanger che richiede più tempo.
NGS presenta molti vantaggi rispetto al metodo Sanger di sequenziamento convenzionale. È un processo ad alta velocità, più accurato ed economico che può essere eseguito con un campione di piccole dimensioni. NGS può essere utilizzato negli studi metagenomici, nella rilevazione di variazioni all'interno di un singolo genoma dovute a inserzioni e delezioni ecc. E nell'analisi delle espressioni geniche.
Figura_1: sviluppi nel sequenziamento NGS
Cos'è il sequenziamento di Sanger?
Sanger Sequencing è un metodo di sequenziamento sviluppato da Frederick Sanger e dai suoi colleghi nel 1977 per determinare il preciso ordine nucleotidico di un dato frammento di DNA. È anche noto come sequenziamento della terminazione della catena o sequenziamento Dideoxy. Il principio di funzionamento di questo metodo è la fine della sintesi del filamento mediante l'incorporazione selettiva di dideoxynucleotides di terminazione della catena (ddNTP) come ddGTP, ddCTP, ddATP e ddTTP da parte della DNA polimerasi durante la replicazione del DNA. I nucleotidi normali hanno gruppi 3 'OH per la formazione di un legame fosfodiestere tra nucleotidi adiacenti per continuare la formazione del filamento. Tuttavia, i ddNTP mancano di questo gruppo 3 'OH e non sono in grado di formare legami fosfodiestere tra nucleotidi. Quindi, l'allungamento della catena è cessato.
In questo metodo, il DNA a filamento singolo da sequenziare funge da filamento modello per la sintesi del DNA in vitro. Altri requisiti sono il primer oligonucleotidico, i precursori dei deossinucleotidi e l'enzima DNA polimerasi. Quando le estremità fiancheggianti del frammento bersaglio sono note, i primer possono essere facilmente progettati per la replicazione del DNA. Quattro reazioni di sintesi del DNA separate vengono eseguite in quattro provette separate. Ogni tubo ha ddNTP separati, insieme ad altri requisiti. Dal particolare nucleotide, viene aggiunta una miscela di dNTP e ddNTP. Allo stesso modo, quattro reazioni separate vengono eseguite in quattro tubi con quattro miscele. Dopo le reazioni, vengono eseguite la rilevazione dei frammenti di DNA e la conversione del pattern dei frammenti in informazioni sulla sequenza. I frammenti di DNA risultanti vengono denaturati a caldo e separati mediante elettroforesi su gel. Se vengono utilizzati nucleotidi radioattivi, lo schema di bande nel gel di poliacrilammide può essere visualizzato mediante autoradiografia. Quando questo metodo utilizza i dideoxynucleotides marcati in modo fluorescente, può essere mitigato lungo il gel letto e passato attraverso un raggio laser per essere rilevato dal rivelatore fluorescente. Per evitare errori che potrebbero sorgere quando una sequenza viene letta dall'occhio e inserita manualmente in un computer, questo metodo si è sviluppato nell'uso del sequencer automatico accoppiato al computer. Per evitare errori che potrebbero sorgere quando una sequenza viene letta dall'occhio e inserita manualmente in un computer, questo metodo si è sviluppato nell'uso del sequencer automatico accoppiato al computer. Per evitare errori che potrebbero sorgere quando una sequenza viene letta dall'occhio e inserita manualmente in un computer, questo metodo si è sviluppato nell'uso del sequencer automatizzato accoppiato al computer.
Questo è il metodo utilizzato per sequenziare il DNA dal progetto Human Genome. Questo metodo è ancora in uso con modifiche avanzate perché fornisce informazioni accurate sulla sequenza nonostante sia un processo costoso e lento.
Figura_2: sequenziamento di Sanger
Qual è la differenza tra NGS e Sanger Sequencing?
Articolo diff. Al centro prima della tabella
NGS vs Sanger Sequencing |
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| Next Generation Sequencing (NGS) si riferisce ai moderni processi di sequenziamento ad alto rendimento. Descrive una serie di diverse moderne tecnologie di sequenziamento | Sanger Sequencing è un metodo di sequenziamento sviluppato da Frederick Sanger per determinare l'ordine preciso dei nucleotidi di un dato frammento di DNA. |
| Efficacia dei costi | |
| NGS è un processo più economico perché riduce tempo, forza lavoro e prodotti chimici. | Questo è un processo costoso perché richiede tempo, forza lavoro e più sostanze chimiche. |
| Velocità | |
| Ciò è più rapido poiché sia il rilevamento chimico che il rilevamento del segnale di molti filamenti avvengono parallelamente. | Questo richiede tempo poiché il rilevamento chimico e il rilevamento del segnale avvengono come due processi separati e solo su trefolo può leggere alla volta. |
| Affidabilità | |
| NGS è affidabile. | Il sequenziamento di Sanger è meno affidabile |
| Misura di prova | |
| NGS richiede una minore quantità di DNA. | Questo metodo richiede una grande quantità di DNA stampo. |
| Basi di DNA per frammento sequenziato | |
| Il numero di basi di DNA per frammento sequenziato è inferiore rispetto al metodo Sanger | Le sequenze di generazione sono più lunghe delle sequenze NGS. |
Riepilogo - NGS vs Sanger Sequencing
NGS e Sanger Sequencing sono tecniche di sequenziamento nucleotidico ampiamente utilizzate in Biologia Molecolare. Il sequenziamento di Sanger è un metodo di sequenziamento precoce che è stato sostituito da NGS. La differenza principale tra NGS e Sanger Sequencing è che NGS è un processo ad alta velocità, più accurato ed economico rispetto al sequencing Sanger. Entrambe le tecniche hanno creato importanti focolai in genetica e biotecnologia.
