Differenza chiave - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Il sequenziamento del DNA è molto importante per l'analisi del DNA poiché la conoscenza della corretta disposizione dei nucleotidi su una particolare regione del DNA rivela molte informazioni importanti su di essa. Esistono diversi metodi di sequenziamento del DNA. Il sequenziamento di Sanger e il pirosequenziamento sono due diversi metodi di sequenziamento del DNA ampiamente utilizzati in biologia molecolare. La differenza chiave tra il sequenziamento di Sanger e il pirosequenziamento è che il sequenziamento di Sanger utilizza i dideoxinucleotidi per terminare la sintesi del DNA per leggere la sequenza nucleotidica mentre il pirosequenziamento rileva il rilascio di pirofosfato incorporando i nucleotidi e sintetizzando la sequenza complementare per leggere l'ordine preciso della sequenza.
INDICE
1. Panoramica e differenza chiave
2. Che cos'è il sequenziamento di Sanger
3. Che cos'è il pirosequenziamento
4. Confronto affiancato - Sequenziamento di Sanger vs pirosequenziamento
5. Riepilogo
Cos'è il sequenziamento di Sanger?
Il sequenziamento di Sanger è un metodo di sequenziamento del DNA di prima generazione sviluppato da Frederick Sanger e dai suoi college nel 1977. È noto anche come sequenziamento della terminazione della catena o sequenziamento Dideoxy poiché si basa sulla terminazione della catena mediante dideoxinucleotidi (ddNTP). Questo metodo è stato ampiamente utilizzato per più di 30 anni fino allo sviluppo del New Generation Sequencing (NGS). La tecnica di sequenziamento di Sanger ha consentito la scoperta del corretto ordine dei nucleotidi o l'attaccamento di un particolare frammento di DNA. Si basa sull'incorporazione selettiva di ddNTP e sulla cessazione della sintesi del DNA durante la replicazione del DNA in vitro. L'assenza di gruppi 3 'OH per continuare la formazione di legami fosfodiestere tra nucleotidi adiacenti è una caratteristica unica dei ddNTP. Quindi, una volta che il ddNTP è attaccato, l'allungamento della catena cessa e termina da quel punto. Ci sono quattro ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP - utilizzati nel sequenziamento di Sanger. Questi nucleotidi arrestano il processo di replicazione del DNA quando vengono incorporati nel filamento di DNA in crescita e provocano lunghezze variabili di DNA corto. L'elettroforesi su gel capillare viene utilizzata per organizzare questi brevi filamenti di DNA in base alle loro dimensioni su un gel come mostrato nella Figura 01.
Figura 1: elettroforesi su gel capillare di DNA corto sintetizzato
Per la replicazione in vitro del DNA, dovrebbero essere forniti pochi requisiti. Sono enzima DNA polimerasi, DNA stampo, primer oligonucleotidici e deossinucleotidi (dNTP). Nel sequenziamento di Sanger, la replicazione del DNA viene eseguita in quattro provette separate insieme a quattro tipi di ddNTP separatamente. I deossinucleotidi non sono totalmente sostituiti dai rispettivi ddNTP. Una miscela del particolare dNTP (ad esempio; dATP + ddATP) è inclusa nella provetta e replicata. Quattro prodotti provetta separati vengono eseguiti su un gel in quattro pozzetti separati. Quindi leggendo il gel, la sequenza può essere costruita come mostrato nella Figura 02.
Figura 02: sequenziamento di Sanger
Il sequenziamento di Sanger è una tecnica importante che aiuta in molte aree della biologia molecolare. Il progetto sul genoma umano è stato completato con successo con l'aiuto dei metodi basati sul sequenziamento di Sanger. Il sequenziamento di Sanger è utile anche nel sequenziamento del DNA target, nella ricerca sul cancro e sulle malattie genetiche, nell'analisi dell'espressione genica, nell'identificazione umana, nel rilevamento di patogeni, nel sequenziamento microbico ecc.
Ci sono diversi svantaggi del sequenziamento di Sanger:
- La lunghezza del DNA sequenziato non può essere superiore a 1000 paia di basi
- È possibile sequenziare un solo filo alla volta.
- Il processo richiede tempo e denaro.
Pertanto, nuove tecniche di sequenziamento avanzate sono state sviluppate con il tempo per superare questi problemi. Tuttavia, il sequenziamento di Sanger è ancora in uso grazie ai suoi risultati estremamente accurati fino a circa 850 frammenti di lunghezza della coppia di basi.
Cos'è il pirosequenziamento?
Il pirosequenziamento è una nuova tecnica di sequenziamento del DNA basata sul "sequenziamento per sintesi". Questa tecnica si basa sulla rilevazione del rilascio di pirofosfato all'incorporazione di nucleotidi. Il processo è impiegato da quattro diversi enzimi: DNA polimero, ATP sulfurilasi, luciferasi e apirasi e due substrati adenosina 5 'fosfosolfato (APS) e luciferina.
Il processo inizia con il legame del primer con lo stampo di DNA a filamento singolo e la DNA polimerasi avvia l'incorporazione di nucleotidi ad esso complementari. Quando i nucleotidi si uniscono (polimerizzazione dell'acido nucleico), rilascia gruppi ed energia pirofosfato (due gruppi fosfato legati insieme). Ogni aggiunta di nucleotidi rilascia una quantità equimolare di pirofosfato. Il pirofosfato si converte in ATP dall'ATP sulfurilasi in presenza del substrato APS. L'ATP generato guida la conversione mediata dalla luciferasi della luciferina in ossiluciferina, producendo luce visibile in quantità proporzionali alla quantità di ATP. La luce viene rilevata da un dispositivo di rilevamento di fotoni o da un fotomoltiplicatore e crea un pirogramma. L'apirasi degrada l'ATP e i dNTP non incorporati nella miscela di reazione. L'aggiunta di dNTP viene eseguita una volta alla volta. Poiché l'aggiunta di nucleotide è nota in base all'incorporazione e alla rilevazione della luce, è possibile determinare la sequenza dello stampo. Il pirogramma viene utilizzato per generare la sequenza nucleotidica del campione di DNA come mostrato nella Figura 03.
Il pirosequenziamento è molto importante nell'analisi del polimorfismo a singolo nucleotide e nel sequenziamento di brevi tratti di DNA. L'elevata precisione, flessibilità, facilità di automazione e elaborazione parallela sono i vantaggi del pirosequenziamento rispetto alle tecniche di sequenziamento di Sanger.
Figura 03: pirosequenziamento
Qual è la differenza tra Sanger Sequencing e Pyrosequencing?
Articolo diff. Al centro prima della tabella
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
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| Il sequenziamento di Sanger è un metodo di sequenziamento del DNA basato sull'incorporazione selettiva di ddNTP mediante DNA polimerasi e terminazione della catena. | Il pirosequenziamento è un metodo di sequenziamento del DNA basato sulla rilevazione del rilascio di pirofosfato all'incorporazione di nucleotidi. |
| Uso di ddNTP | |
| I ddNTP vengono utilizzati per terminare la replicazione del DNA | I ddNTP non vengono utilizzati. |
| Enzimi coinvolti | |
| Viene utilizzata la DNA polimerasi. | Vengono utilizzati quattro enzimi: DNA polimerasi, ATP sulfurilasi, luciferasi e apirasi. |
| Substrati utilizzati | |
| APS e Luciferin non vengono utilizzati. | Vengono utilizzati adenosina 5 'fosfosolfato (APS) e luciferina. |
| Temperatura massima | |
| Questo è un processo lento. | Questo è un processo veloce. |
Riepilogo - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Il sequenziamento di Sanger e il pirosequenziamento sono due metodi di sequenziamento del DNA utilizzati in biologia molecolare. Il sequenziamento di Sanger costruisce l'ordine dei nucleotidi in sequenza terminando l'allungamento della catena mentre il pirosequenziamento costruisce l'ordine preciso dei nucleotidi in sequenza incorporando i nucleotidi e rilevando il rilascio di pirofosfati. Pertanto, la principale differenza tra il sequenziamento di Sanger e il pirosequenziamento è che il sequenziamento di Sanger funziona sul sequenziamento per terminazione della catena mentre il pirosequenziamento funziona sul sequenziamento per sintesi.
