Differenza chiave - Northern vs Southern vs Western Blotting
La rilevazione di sequenze specifiche di DNA, RNA e proteine è essenziale per vari tipi di studi di biologia molecolare. L'elettroforesi su gel è una tecnica che separa DNA, RNA e proteine in base alle loro dimensioni. Dai profili del gel, una particolare sequenza di DNA, sequenza di RNA o proteina vengono rilevate mediante tecniche speciali chiamate blotting e ibridazione con sonde etichettate. Esistono tre diversi tipi di metodi di assorbimento: meridionale, settentrionale e occidentale. La differenza fondamentale tra il blotting settentrionale e quello occidentale risiede nel tipo di molecola che rileva da un campione. Il Southern blotting è un metodo che rileva una sequenza di DNA specifica da un campione di DNA. Il Northern blotting è una tecnica che rileva una sequenza di RNA specifica da un campione di RNA. Il western blotting è un metodo che rileva una proteina specifica da un campione di proteine.
INDICE
1. Panoramica e differenza fondamentale
2. Che cos'è il Southern Blotting
3. Che cos'è il Northern Blot
4. Che cos'è il Western Blot
5. Confronto affiancato - Northern vs Southern vs Western Blotting
6. Riepilogo
Cos'è il Southern Blotting?
La tecnica del Southern blotting è stata sviluppata da EM Southern nel 1975 per l'identificazione di una specifica sequenza di DNA da un campione di DNA. Questa è la prima tecnica di blotting introdotta nella biologia molecolare. Ha consentito la rilevazione di geni specifici dal DNA, frammenti specifici di DNA, ecc. Ci sono diversi passaggi coinvolti nella tecnica del Southern blotting. Sono i seguenti.
- Il DNA viene isolato dal campione e digerito con endonucleasi di restrizione.
- Il campione digerito viene separato mediante elettroforesi su gel di agarosio.
- I frammenti di DNA nel gel vengono denaturati in singoli filamenti mediante l'uso di una soluzione alcalina.
- Il DNA a filamento singolo viene trasferito a una membrana filtrante in nitrocellulosa mediante trasferimento capillare.
- Il DNA trasferito viene fissato sulla membrana in modo permanente.
- Il DNA fisso sulla membrana viene ibridato con sonde etichettate.
- Il DNA non legato viene lavato via dalla membrana mediante lavaggio.
- La pellicola radiografica viene esposta alla membrana e viene preparato un autoradiografo.
Il Southern blotting viene applicato per diversi aspetti della biologia molecolare. È utile nella mappatura RFLP, negli studi forensi, nella metilazione del DNA nell'espressione genica, nella rilevazione di geni mutati in malattie genetiche, nel fingerprinting del DNA, ecc.
Figura 01: tecnica del Southern Blotting
Cos'è il Northern Blotting?
Il Northern blotting è un metodo progettato per rilevare una sequenza di RNA specifica o una sequenza di mRNA da un campione per studiare l'espressione genica. Questa tecnica è stata sviluppata da Alwine, Kemp e Stark nel 1979. Si differenzia dalle tecniche di western blotting e western blotting per diversi passaggi. Tuttavia, questa tecnica viene eseguita anche tramite elettroforesi su gel, blotting e ibridazione con sonde e rilevamento etichettati specifici. La tecnica del Northern blotting viene eseguita come segue.
- L'RNA viene estratto dal campione e separato mediante elettroforesi su gel.
- L'RNA viene trasferito dal gel su una membrana assorbente e fissato.
- La membrana viene trattata con una sonda etichettata preparata da cDNA o RNA (la sonda è complementare a una sequenza specifica nel campione).
- La sonda viene incubata con la membrana per legarsi con una sequenza specifica.
- Le sonde non legate vengono lavate via.
- I frammenti ibridati vengono rilevati da un autoradiografo.
Il Northern blotting è uno strumento importante per il rilevamento e la quantificazione dell'mRNA ibridato, lo studio della degradazione dell'RNA, la valutazione dell'emivita dell'RNA, il rilevamento dello splicing dell'RNA, lo studio dell'espressione genica, ecc.
Figura 02: Northern Blotting
Cos'è il Western Blotting?
Il western blotting è un metodo per rilevare una specifica proteina da una miscela di proteine mediante l'uso di anticorpi marcati. Pertanto, il western blot è anche noto come immunoblot. Questa tecnica è stata introdotta da Towbin et al nel 1979 ed è ora eseguita di routine nei laboratori per l'analisi delle proteine. I passaggi sono i seguenti.
- Le proteine vengono estratte dal campione
- Le proteine sono separate dalle loro dimensioni usando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide
- Le molecole separate vengono trasferite in una membrana PVDF o in una membrana di nitrocellulosa mediante elettroporazione
- La membrana è bloccata per il legame aspecifico con gli anticorpi
- Le proteine trasferite si legano all'anticorpo primario (anticorpi marcati con enzimi).
- La membrana viene lavata per rimuovere gli anticorpi primari legati in modo non specifico
- Gli anticorpi legati vengono rilevati aggiungendo un substrato e rilevando il precipitato colorato formato
Il western blotting è utile per rilevare gli anticorpi anti-HIV in un campione di siero umano. Il Western blot può essere utilizzato anche come test di conferma per l'infezione da epatite B e test definitivo per la malattia della mucca pazza.
Figura 03: Western blotting
Qual è la differenza tra Northern Southern e Western Blotting?
Articolo diff. Al centro prima della tabella
Northern vs Southern vs Western Blotting |
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| Tipo di molecola rilevata | |
| Northern blotting | Il Northern blotting rileva una sequenza di RNA specifica da un campione di RNA. |
| Macchia meridionale | Il Southern blotting rileva una sequenza di DNA specifica da un campione di DNA. |
| Western blotting | Il Western blotting rileva una proteina specifica da un campione di proteine. |
| Tipo di gel | |
| Northern blotting | Questo utilizza gel di agarosio / formaldeide. |
| Macchia meridionale | Questo utilizza un gel di agarosio. |
| Western blotting | Questo utilizza gel di poliacrilammide. |
| Metodo di blotting | |
| Northern blotting | Questo è un trasferimento capillare. |
| Macchia meridionale | Questo è un trasferimento capillare. |
| Western blotting | Questo è un trasferimento elettrico. |
| Sonde utilizzate | |
| Northern blotting | sonde di cDNA o RNA marcate radioattivamente o non radioattivamente. |
| Macchia meridionale | Le sonde di DNA sono etichettate radioattivamente o non radioattivamente. |
| Western blotting | Gli anticorpi primari sono usati come sonde. |
| Sistema di rilevamento | |
| Northern blotting | Questo viene fatto utilizzando un autoradiografo o il rilevamento della luce o del cambiamento di colore. |
| Macchia meridionale | Questo viene fatto utilizzando un autoradiografo, rilevamento della luce o cambiamento di colore. |
| Western blotting | Questo viene fatto utilizzando il rilevamento della luce o del cambiamento di colore. |
Riepilogo - Northern vs Southern vs Western Blotting
Il blotting è una tecnica speciale sviluppata per l'identificazione di DNA, RNA o proteine specifici dai campioni. Esistono tre procedure di assorbimento separate, ovvero settentrionale, meridionale e occidentale, per rilevare un tipo specifico di molecola. La tecnica del Northern blotting è progettata per rilevare una sequenza di RNA specifica da una miscela di RNA. La tecnica del Southern blotting consente il rilevamento di una specifica sequenza di DNA da un campione di DNA e la tecnica del western blotting è sviluppata per identificare una specifica proteina da una miscela proteica.
