Differenza chiave - Microarray vs sequenziamento dell'RNA
Il trascrittoma rappresenta l'intero contenuto di RNA presente in una cellula inclusi mRNA, rRNA, tRNA, RNA degradato e RNA non degradato. La creazione di profili del trascrittoma è un processo importante per comprendere le intuizioni cellulari. Esistono diversi metodi avanzati per la profilazione del trascrittoma. Il sequenziamento di microarray e RNA sono due tipi di tecnologie sviluppate per analizzare il trascrittoma. La differenza chiave tra microarray e sequenziamento dell'RNA è che il microarray si basa sul potenziale di ibridazione di sonde etichettate predisegnate con sequenze di cDNA target mentre il sequenziamento dell'RNA si basa sul sequenziamento diretto di filamenti di cDNA mediante tecniche di sequenziamento avanzate come NGS. Il microarray viene eseguito con la conoscenza preliminare delle sequenze e il sequenziamento dell'RNA viene eseguito senza la conoscenza preliminare delle sequenze.
CONTENUTO
1. Panoramica e differenza chiave
2. Che cos'è Microarray
3. Che cos'è il sequenziamento dell'RNA
4. Confronto affiancato - Microarray vs sequenziamento dell'RNA
5. Riepilogo
Cos'è Microarray?
Microarray è un metodo robusto, affidabile e ad alto rendimento utilizzato per la profilazione del trascrittoma dagli scienziati. È l'approccio più popolare per l'analisi della trascrizione. È un metodo a basso costo, che dipende dalle sonde di ibridazione.
La tecnica inizia con l'estrazione dell'mRNA dal campione e la costruzione della libreria di cDNA dall'RNA totale. Quindi viene miscelato con sonde pre-progettate con etichetta fluorescente su una superficie solida (matrice spot). Le sequenze complementari si ibridano con le sonde etichettate nel microarray. Quindi il microarray viene lavato e schermato e l'immagine viene quantificata. I dati raccolti dovrebbero essere analizzati per ottenere i relativi profili di espressione.
Si presume che l'intensità delle sonde microarray sia proporzionale alla quantità di trascritti nel campione. Tuttavia, l'accuratezza della tecnica dipende dalle sonde progettate, dalla conoscenza preliminare della sequenza e dall'affinità delle sonde per l'ibridazione. Quindi la tecnologia microarray ha dei limiti. La tecnica Microarray non può essere eseguita con trascritti a bassa abbondanza. Non riesce a differenziare le isoforme e identificare le varianti genetiche. Poiché questo metodo dipende dall'ibridazione delle sonde, nella tecnica del microarray si verificano alcuni problemi relativi all'ibridazione come l'ibridazione incrociata, l'ibridazione aspecifica, ecc.
Figura 01: Microarray
Cos'è il sequenziamento dell'RNA?
RNA shotgun sequencing (RNA seq) è una tecnica di sequenziamento dell'intero trascrittoma recentemente sviluppata. È un metodo rapido e ad alta produttività per la profilazione del trascrittoma. Quantifica direttamente l'espressione dei geni e si traduce in un'indagine approfondita del trascrittoma. L'RNA seq non dipende da sonde predefinite o da una conoscenza preliminare delle sequenze. Pertanto, il metodo RNA seq ha un'elevata sensibilità e capacità di rilevare nuovi geni e varianti genetiche.
Il metodo di sequenziamento dell'RNA viene eseguito in diversi passaggi. L'RNA totale della cellula deve essere isolato e frammentato. Quindi, utilizzando la trascrittasi inversa, è necessario preparare una libreria di cDNA. Ogni filamento di cDNA deve essere legato con adattatori. Quindi i frammenti ligati devono essere amplificati e purificati. Infine, utilizzando un metodo NGS, è necessario eseguire il sequenziamento del cDNA.
Figura 02: sequenziamento dell'RNA
Qual è la differenza tra Microarray e sequenziamento dell'RNA?
Articolo diff. Al centro prima della tabella
Microarray vs sequenziamento dell'RNA |
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| Microarray è un metodo robusto, affidabile e ad alta produttività. | Il sequenziamento dell'RNA è un metodo accurato e ad alta produttività. |
| Costo | |
| Questo è un metodo a basso costo. | Questo è un metodo costoso. |
| Analisi di un gran numero di campioni | |
| Ciò facilita l'analisi simultanea di un gran numero di campioni. | Ciò facilita l'analisi di un gran numero di campioni. |
| Analisi dei dati | |
| L'analisi dei dati è complessa. | Con questo metodo vengono generati più dati; quindi, il processo è più complesso. |
| Conoscenza preliminare delle sequenze | |
| Questo metodo si basa su sonde di ibridazione, quindi è richiesta una conoscenza preliminare delle sequenze. | Questo metodo non dipende dalla conoscenza della sequenza precedente. |
| Variazioni strutturali e nuovi geni | |
| Questo metodo non è in grado di rilevare variazioni strutturali e nuovi geni. | Questo metodo può rilevare variazioni strutturali come fusione genica, splicing alternativo e nuovi geni. |
| Sensibilità | |
| Questo non può rilevare differenze nell'espressione delle isoforme, quindi ha una sensibilità limitata. | Questo ha un'elevata sensibilità. |
| Risultato | |
| Ciò può portare solo a livelli di espressione relativi. Questo non fornisce una quantificazione assoluta dell'espressione genica. | Fornisce livelli di espressione assoluti e relativi. |
| Rianalisi dei dati | |
| Questo deve essere rieseguito per rianalizzare. | I dati di sequenziamento possono essere rianalizzati. |
| Necessità di personale e infrastrutture specifiche | |
| Non sono necessarie infrastrutture e personale specifici per il microarray. | Infrastruttura e personale specifici richiesti dal sequenziamento dell'RNA. |
| Problemi tecnici | |
| La tecnica del microarray presenta problemi tecnici come ibridazione incrociata, ibridazione aspecifica, tasso di rilevamento limitato delle singole sonde, ecc. | La tecnica RNA seq evita problemi tecnici come ibridazione incrociata, ibridazione aspecifica, tasso di rilevamento limitato delle singole sonde, ecc. |
| Bias | |
| Questo è un metodo parziale poiché dipende dall'ibridazione. | Il bias è basso rispetto al microarray. |
Riepilogo - Microarray vs sequenziamento dell'RNA
I metodi di sequenziamento di microarray e RNA sono piattaforme ad alto rendimento sviluppate per la profilazione del trascrittoma. Entrambi i metodi producono risultati altamente correlati ai profili di espressione genica. Tuttavia, il sequenziamento dell'RNA presenta vantaggi rispetto al microarray per l'analisi dell'espressione genica. Il sequenziamento dell'RNA è un metodo più sensibile per il rilevamento di trascritti a bassa abbondanza rispetto al microarray. Il sequenziamento dell'RNA consente anche la differenziazione tra isoforme e l'identificazione di varianti geniche. Tuttavia, il microarray è la scelta comune della maggior parte dei ricercatori poiché il sequenziamento dell'RNA è una tecnica nuova e costosa con problemi di archiviazione dei dati e analisi dei dati complesse.
