Differenza chiave: primer per PCR vs primer di sequenziamento
Con i recenti sviluppi nel campo della biologia molecolare, sono state sviluppate diverse tecniche genetiche che hanno reso facili ed accurati i processi di indagine delle diverse vie della materia. La PCR e altre procedure di sequenziamento sono due importanti tecniche di questo tipo. Usano diversi sottocomponenti. I primer sono considerati il principale sottocomponente comune alle tecniche di PCR e di sequenziamento. I primer PCR vengono utilizzati per l'amplificazione di una particolare sequenza di DNA, mentre i primer di sequenziamento vengono utilizzati nel contesto del sequenziamento di un frammento di DNA con l'intenzione di rivelare il suo ordine specifico della sequenza nucleotidica. Questa è la differenza fondamentale tra i primer PCR e i primer di sequenziamento.
CONTENUTI
1. Panoramica e differenza chiave
2. Cosa sono i primer PCR
3. Cosa sono i primer di sequenziamento
4. Somiglianze tra primer PCR e primer di sequenziamento
5. Confronto affiancato - Primer PCR vs primer di sequenziamento in forma tabulare
6. Riepilogo
Cosa sono i primer per PCR?
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica genetica che viene utilizzata nel campo della biologia molecolare per amplificare una o poche copie di un particolare segmento di DNA e per ottenere molti milioni di copie identiche. In una reazione PCR, vengono utilizzati diversi componenti, inclusi i primer. I primer sono brevi filamenti di DNA con una lunghezza del nucleotide di 18-25 che li rende compatibili con la regione iniziale e finale dei frammenti di DNA da amplificare. I primer possono essere un primer diretto e un primer inverso. Questi primer si legano al frammento di DNA nei punti specifici in cui fa sì che la DNA polimerasi si leghi al primer specifico nel punto e avviano la sintesi del nuovo filamento di DNA.
La selezione dei primer è un aspetto importante del processo di PCR. La selezione della lunghezza del primer è importante. La lunghezza ideale sarebbe 18-25 nucleotidi. Se la lunghezza è troppo corta o troppo lunga, i primer non si legheranno alla sequenza di DNA per essere amplificati accuratamente. I primer di lunghezza troppo corta portano alla ricottura dei primer non specifici in diverse posizioni della sequenza di DNA.
Figura 01: primer per PCR
Il contenuto di guanina e citosina (GC) in un buon primer dovrebbe essere compreso tra 40 e 60. La temperatura di ricottura del primer e la temperatura di fusione sono fattori vitali durante la PCR. La temperatura di fusione deve essere calcolata accuratamente e la temperatura di ricottura del primer deve essere di 5 ° C inferiore alla temperatura di fusione. La temperatura di fusione dovrebbe essere di 60 ° C e 75 ° C. Temperature troppo alte o troppo basse risulteranno in un'attività della DNA polimerasi meno attiva.
Cosa sono i primer di sequenziamento?
I primer di sequenziamento vengono utilizzati nel contesto del sequenziamento di un frammento di DNA con l'intenzione di rivelarne l'identità specifica. Per ottenere buoni risultati di sequenziamento sono importanti primer e modelli di alta qualità. Pertanto, quando vengono selezionati i primer, dovrebbero essere unici per una particolare regione in cui desideriamo sequenziare. Dovrebbe anche essere con un orientamento corretto dove le sequenze vengono generalmente generate dalle estremità da 3 'a 5' dei primer. La sequenza dovrebbe essere priva di autoibridazione indesiderabile come la formazione di anelli a forcina. Non dovrebbe contenere la formazione consecutiva di basi di guanina.
La temperatura di fusione (Tm) del primer deve essere adeguata alle condizioni del sequenziamento. Pertanto, dovrebbe essere compreso tra 52 o C e 74 o C. La preparazione degli oligonucleotidi da utilizzare come primer deve essere purificata per ottenere l'intera lunghezza desiderata della sequenza. Se gli oligonucleotidi contengono impurità, la segnalazione della sequenza di primer sarà sovrapposta da diversi siti di priming e diminuirà anche il numero di cellule di base.
Figura 02: primer di sequenziamento
La temperatura di fusione del primer (Tm) di un oligonucleotide determina quanto sono forti i filamenti di DNA complementari ibridati tra loro. Tm può essere considerato come un calcolo termodinamico in cui dipende sia dalle sequenze di DNA che da diverse condizioni come la concentrazione di sale. La Tm è importante durante la PCR in cui una variante chiamata sequenziamento del ciclo viene utilizzata per produrre un gruppo di frammenti terminati da dideoxinucleotidi. Qui, il primer che viene sequenziato verrà inizialmente ricotto alternativamente, quindi esteso e infine denaturato per l'amplificazione. Pertanto, il valore Tm dovrebbe essere compreso tra 52 o C e 74 oC. Gli oligonucleotidi sintetizzati possono essere ottenuti da laboratori di sintesi di DNA / RNA come da scelta. La piccola scala di sintesi utilizzata per il sequenziamento del DNA è solitamente di 50 nmol. Inoltre, cosa più importante, i primer utilizzati per il sequenziamento dovrebbero essere purificati per essere privi di impurità che impediranno la riduzione della qualità.
Quali sono le somiglianze tra i primer per PCR e i primer di sequenziamento?
- Sia i primer per PCR che i primer di sequenziamento sono primer utilizzati nel processo di amplificazione di una sequenza di DNA mirata.
- Sia i primer per PCR che i primer di sequenziamento sono composti da nucleotidi.
- Sia i primer per PCR che i primer di sequenziamento sono oligomeri corti.
Qual è la differenza tra i primer per PCR e i primer di sequenziamento?
Articolo diff. Al centro prima della tabella
Primer PCR vs Primer di sequenziamento |
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| I primer PCR sono brevi filamenti di DNA con una lunghezza della sequenza nucleotidica di 18-25 che li rende compatibili con la regione iniziale e finale dei frammenti di DNA che devono essere amplificati. | I primer di sequenziamento sono oligomeri brevi che vengono utilizzati nel contesto del sequenziamento di un frammento di DNA con l'intenzione di rivelare la sua identità specifica. |
| Funzione | |
| I primer PCR vengono utilizzati per l'amplificazione di una particolare sequenza di DNA. | I primer di sequenziamento vengono utilizzati nel contesto del sequenziamento di un frammento di DNA con l'intenzione di rivelarne l'identità specifica. |
| Numero di primer necessari | |
| Due primer; come primer PCR vengono utilizzati un primer diretto e un primer inverso. | Serve un solo primer come primer di sequenziamento. |
Riepilogo: primer per PCR vs primer di sequenziamento
I primer di sequenziamento vengono utilizzati nel contesto del sequenziamento di un frammento di DNA con l'intenzione di rivelarne l'identità specifica. Un primer di sequenziamento sarà sufficiente per eseguire il processo. Per ottenere buoni risultati di sequenziamento, primer e modelli di alta qualità sono importanti. Pertanto, quando vengono selezionati i primer, dovrebbero essere unici per una particolare regione in cui desideriamo sequenziare. I primer per PCR sono brevi filamenti di DNA con una lunghezza nucleotidica di 18-25 che è compatibile con la regione iniziale e finale dei frammenti di DNA che devono essere amplificati. I primer PCR possono essere un primer diretto e un primer inverso. Il contenuto di guanina e citosina (GC) in un buon primer dovrebbe essere compreso tra 40 e 60. La temperatura di ricottura del primer e la temperatura di fusione sono aspetti vitali durante la PCR. Questa è la differenza tra primer per PCR e primer di sequenziamento.
